СОДЕРЖАНИЕ

 TOC \o "1-2" \h \z \u Введение. \h 4

1.... Производные аминоакридина: получение и противомикробная активность (обзор литературы) \h 5

1.1   Исходные акридинилирующие агенты и акридон. \h 5

1.2   Методы получения гидразиноакридинов. PAGEREF _Toc167886832 \h 8

1.3   Антибактериальная активность производных акридина. \h 11

1.4   Биологическая активность гидразонов акридона. PAGEREF _Toc167886834 \h 12

2.... Обсуждение результатов. \h 14

2.1   Синтез исходных акридона, 9-хлоракридина и 9-метоксиакридина. \h 15

2.2   Синтез исходных гидразидов N,N-диалкилированого глицина. \h 17

2.3   Синтез исходных гидразидов N,N-диалкилированой ГАМК.. \h 18

2.4   Синтез гидразонов акридона. \h 20

2.5   Изучение противобактериальной активности гидразонов акридона. \h 24

3.... Экспериментальная часть. \h 27

3.1   Химическая экспериментальная часть. \h 27

3.2   Биологическая экспериментальная часть. \h 29

Выводы.. \h 30

Литература. \h 31

Введение

Производные 9-аминоакридина являются одним из наиболее изученных классов гетероциклических соединений с точки зрения их биологической активности.

К этому классу относятся противомалярийный препарат акрихин, противоопухолевые агенты AMSA и нитракрин, акридиниламиноспирты и бис-акридины, обладающие противовирусным и интерферониндуцирующим действием. Для производных акридинилгидразина показано противовирусная и антитрипаносомозная активность. Многие аминоакридины обладают значительным противомикробным потенциалиом.

В основе большинства видов биологической активности производных 9-аминоакридина лежит их способность к интеркаляции в ДНК. Примечательно, что именно 9-аминоакридин и его аналоги явились первыми из изученных интеркаляторов.

Ранее было обнаружено, что акридинилгидразоны N,N-диалкилированного глицина являются интеркаляторами ДНК средней силы и эффективно ингибируют матричные функции ДНК в условиях ПЦР, являются эффективными противовирусными и интерферониндуцирующими агентами. В связи с этим, в рамках рабочей гипотезы о потенциальной активности интеркаляторов относительно любых объектов – носителей доступной ДНК, было выдвинуто предположение о наличии у гидразонов акридона противобактериальной активности.

В связи с этим целью работы был ресинтез описаных ранее акридинилгидразонов N,N-диалкилированного глицина и синтез ранее неописаных акридинилгидразонов N,N-диалкилгамма-аминомасляной кислоты и изучение их противобактериальной активности.

Работа является частью исследований, проводимых в отделе медицинской химии Физико-химического института им. А.В. Богатского НАН Украины по целенаправленному созданию нуклеотропных противовирусных, противобактериальных препаратов и индукторов интерфеорона.

1          Производные аминоакридина: получение и противомикробная активность (обзор литературы)

1.1         Исходные акридинилирующие агенты и акридон

Практичеcки вcе опиcанные в литературе акридинcодержащие интерка­ля­то­ры получены конденcацией реакционноcпоcобных производных акридина, таких как 9-хлор­акридин и 9-метоксиакридин, c cоот­ветcт­вующими соединениями, со­дер­жащими амино- или гидразиногруппу. Одним из вариантов получения исходных 9-хлор- и 9-метоксиакридина является метод, при котором сначала получают акридон.

1.1.1     Акридон

          Для получения незамещенного акридона  могут быть иcпользованы мето­ды, оcнованные на непоcредcтвенном окиcлении акридина. Так, 1.2 был получен  окиcлением 1.1 гипобромитом натрия в метаноле по Лехмштедту [[1]] (рис.1.1).

Опиcан метод получения 1.2 обработкой 1.1 надбензойной киcлотой c поcледующей изомеризацией образующегося N-окиcи акридина 1.4 в акридон укcуcным ангидридом [[2]]. Для получения акридонов, не cодержащих амино- и гидрокcильных групп (1.2, где R ¹ NH₂, OH), раcпроcтраненной являетcя циклизация cоот­вет­cтвующих N-фенилантраниловых киcлот 1.5 cерной киcлотой [[3]]. Для акридонов, содержащих амино- и оксигруппы удобным cпоcобом полу­че­ния являетcя изомеризация 3-фенилантранилов 1.3 в уcловиях киcлотного катализа [[4], [5]] или окиcление cоответcтвующих 2-аминобензофенонов 1.6 [[6]] (рис. 1.2)

1.1.2     9-Хлоракридин

В литературе [[7], [8]] описан способ получения 9-хлоракридина 1.7, в ос­но­ве которого лежит циклизация N-фенилантраниловой кислоты 1.5 под действием 8-крат­ного избытка хлорокиси фосфора при кипячении.

 При этом, согласно литера­туре, выходы составляют 65 – 80 %. Ранее было показано [[9]], что умень­ше­ние избытка хлорокиси фосфора из 8 до 1.5-кратного (от расчетного) с разбав­ле­ни­ем реакционной среды хлороформом снижает опасность проведения синтеза и тру­до­емкость стадии нейтрализации, но не уменьшает количество образующихся в результате реакции смолистых примесей.

1.1.3          9-Метоксиакридин

9-Метоксиакридин 1.8 является удобным реагентом при получении произ­вод­ных 9-аминоакридина в мягких условиях [[10]]. От 9-хлоракридина 1.7, применяемого в тех же целях, его выгодно отличают стабильность при хранении и отсутствие по­бочных веществ кислого характера при акридинилировании оснований ами­но­ком­понентов. Основным методом получения 1.8 является обработка 1.7 метилатом натрия в кипящем метаноле (рис. 1.4). Выходы при этом составляют 85 – 90 % [[11]].

С другой стороны, было показано, что абсолютная среда не является обязательной для успешного проведения реакции. 9-Метоксиакридин образуется и в присутствии в качестве основания гидроксида натрия вместо метилата. В этом случае следует считаться с возможностью гидролиза как 9-хлоракридина, так и продукта реакции до акридона, однако скорость этого гидролиза, по-видимому, невелика. При ограниченном времени проведения реакции удается достичь выходов на уровне 65 – 70 %.

1.2         Методы получения гидразиноакридинов

Основной реакцией, лежащей в основе получения производных 9-гидразиноакридинов является реакция замещение у C⁹-атома акридинового цикла (рис. 1.5) [11].

9-хлоракридин явился первым производным акридина, использовавшимся для получения производных 9-гидразиноакридина, при этом наилучшие результаты были достигнуты при проведении  реакции в феноле [[12] – ,[13],[14],[15],[16],[17]].

Несмотря на обратимость реакции и, следовательно, целесообразность введения одного из реагентов в избытке (для смещения равновесия), в большинстве случаев синтезы ведут при соотношении реагентов близких к эквивалентному.

Количество фенола (с учетом его небольшой молекулярной массы) может быть небольшим. В большинстве случаев оно определяется растворимостью реагентов в феноле в выбранных экспериментальных условиях.

В большинстве случаев реакцию по умолчанию проводят при 110 – 120 ^oC, од­нако этот температурный диапазон не является строго обязательным. По-види­мому, реакция не менее успешно может протекать и при меньших температурах.

Так, при акридинилировании гидразидов аминокислот действием 2-метокси-6,9-дихлоракридина применялся следующий температурный режим: 40 мин при 100 ^oC и 150 мин. при 60 – 80 ^oC [[18]]. Одновременно, в работе [ NOTEREF _Ref167714278 \h  \* MERGEFORMAT 9] хорошие выходы были достигнуты при более мягких условиях для акридинилирования менее нуклеофильных аминокомпонентов. К сожалению, данные по рациональному выбору температурного диапазона реакции в доступной литературе нам обнаружить не удалось.

Продолжительность синтеза, необходимая для достижения максимальных вы­­ходов, варьируется в зависимости от нуклеофильности гидразинокомпонента и те­м­пе­ра­туры реакции в широких пределах. Так, при акридинилировании гидразинов дей­ствием 9-хлоракридина, высокие выходы достигаются всего за 30 – 40 минут при 60 – 65 ^oC.  Для достаточно полного акридинилирования 4-нитроанилина требуется нагревание при 120 ^oC в течение 6 часов.

Считается [[19]], что реакция акридинилирования идет в условиях общего кислотного катализа. Именно этим соображением и обуславливают выбор фенола в качестве растворителя. С другой стороны, показано, что при реакции 9-хлоракридина с избытком первичного амина в отсутствии растворителя (т.е в среде, которую следует считать основной) продукты образуются в мягких условиях, быстро и с хорошими выходами [9]. Таким образом целесообразность кислотного катализа и использования фенола в качестве растворителя весьма сомнительна.

Основной проблемой при выделении продуктов акридинилирования является отделение остатков фенола и продуктов его окисления и, с другой стороны, отде­ление побочного продукта – акридона. Если от основной массы фенола удается из­бавиться отмыванием продукта раствором щелочи (при выделении продукта ак­ридинилирования в виде основания) или диэтиловым эфиром (при выделении в ви­де гидрохлорида), то удаление остаточных количеств 1.2 представляет значите­льную проблему. Так, после двух последовательных операций (осаждение основания из водного раствора 1 M раствором NaOH, фильтрование и промывка основания на фильтре водой, перевод полученного основания в гидрохлорид) в продукте все еще оставался фенол на уровне 0.01 – 0.05 % [9].

Удаление акридона является еще более сложной задачей из-за крайне низкой растворимости акридона в большинстве органических растворителей. Так, во всех образцах гидразиноакридинов, полученных из 9-хлоракридина и оснований гидразинов методом полуколичественной ТСХ в присутсвии свидетеля обнаружен акридон на уровне не менее 0.01 %. В отдельных образцах (как правило – акридиниламинокислотах) содержание неудаляемого акридона достигает 1 % [9].

Основными недостатками 9-хлоракридина является его низкая стабильность при хранении, раздражющие свойства и чрезвычайно высокая чувствительность к влаге в условиях синтеза.

Так, при хранении 9-хлоракридина в течение 1 месяца при комнатной температуре он подвергается трансформации на 10 – 15 %, причем акридон составляет не более 7 – 8 %.  Через 1 год хранения при – 18 ^oC в герметично закрытрой таре 9-хлоракридин в образце не обнаруживается.

При попадании на слизистые (твердое вещество или пары) 9-хлоракридин вызывает сильное чувство жжения, а при попадании значительных количеств на незащищенную кожу (особенно в виде раствора в органических растворителях) может вызвать изъязвление. Во всех случаях наблюдается стойкая пигментация покровов. Легко проникает через резиновые перчатки. При работе с ним следует применять специфические меры предосторожности.

При акридинилировании гидразинов действием 9-хлоракридина чрезвычайно важное значение имеет отсутствие влаги в растворителях, поскольку 9-хлоракридин с легкостью подвергается гидролизу и алкоголизу (рис.1.6), катализируемым сильными кислотами, причем реакция является автокаталитической, т.к в результате нее кроме акридона образуется HCl.

Работ, в которых 9-метоксиакридин использовали для синтеза производных 9-амино- и 9-гидразиноакридина, крайне мало. Так, на более чем 200 работ, в которых для получения 9-аминоакридина использован 9-хлоракридин, приходится всего 12 работ, в которых использован 9-метоксиакридин. Для получения производных 9-гидразиноакридина возможность применения 9-метоксиакридина впервые показана в работах сотрудников Физико-химического института им. А.В. Богатского НАН Украины. Этот реагент был применен нами для акридинилирования аминокислот и их эфиров [[20]], акридиниламиноспиртов [[21]], анилинов [[22]], гидразинов [[23]] и гидразидов феноксикарбоновых [[24]] и аминокислот [[25]]. Не рассматривая подробно эти работы отметим лишь основные результаты.

9-Метоксиакридин является эффективным акридинилирующим агентом и позволяет получать производные 9-амино- и 9-гидразиноакридина с высокими выходами и в мягких условиях (кипячение в метаноле).

Скорость реакции в значительной степени зависит от нуклеофильности аминокомпонента и составляет от нескольких секунд (для акридинилирования производных арилгидразинов и семикарбазида) до 8 часов (для анилинов). Для нерастворимых в метаноле аминоксилот и дигидразидов двухосновных кислот продолжительность приходится увеличивать до 12 – 24 часов, соответственно.

При акридинилировании гидрохлоридов аминов категорически необходимо применение абсолютных растворителей и строго контролировать содержание влаги и избыточной HCl в гидрохлоридах аминокомпонентов в связи с чрезвычайно высокой склонностью 9-метоксиакридина к образованию акридона (при наличии в реакционной среде влаги и/или кислоты).

1.3         Антибактериальная активность производных акридина.

Работы по противомикробной активности ряда аминоакридинов, опублико­ван­ные до 1970 года, подробно проанализированы в обзорной статье [[26]], где автором отмечается высокая перспективность акридинов и их амино­про­из­водных в качестве противомикробных агентов при применении in vivo и in vitro, в качестве антисептических агентов и фунгицидов.

Так, производные 9-аминоакридина 1.9 запатентованы [[27]] в качестве антисептических средств. Облучение светом в ряде случаев повышает про­ти­во­бак­териальную активность этих производных [[28]], что дополнительно указывает на опосредование противобактериального действия нуклеиновыми кислотами. В ряде случаев показано ингибирующее действие аминоакридинов на размножение микобактерий [[29]].

В серии работ [[30] – , [31], [32], [33]] показана активность ряда нитропроизводных 9-ами­ноакридина 1.10, зависящая в большей степени от характера и положения за­мес­тителей R и R', чем от положения нитрогруппы.

Бис-акридины при слабом мутагенном эффекте (< 1 % относи­тельно 9-аминокридина или 38.5 мут.кол./мкМ/чашку) являются сильными инги­би­торами роста Salmonella typhimurium (0.17 – 1.84 мкМ / чашку – 50 %) [[34]].

Однозначная корреляция противомикробной активности с интеркалирующей способностью и способностью ингибировать транскрипцию была показана для серии производных акридинона [[35]]. Кроме того, показано [[36]] сильное потенциирование мало­активными (при индивидуальном применении) акридинами действия сульфаниламидных препаратов.

И, наконец, вышедший в 2001 г подробный обзор по антибактериальной активности производных акридина [[37]] показывает, что эти объекты не теряют своей актуальности и работа в этом направлении продолжается.

1.4         Биологическая активность гидразонов акридона

Для гидразонов акридона показано ин­ги­би­рую­щее влияние на различные формы Schistosoma cruzi [[38]].

10-[2-(Диэтиламино)этил]-акридин-9-он-(тиазолидин)гидразон 1.11 проя­ви­л выраженную активность (p.o) относительно Shistosoma mansoni, причем трех­крат­ное применение препарата в дозе 20 мг/кг через 12 недель после инфици­ро­ва­ния мышей приводило к полному исчезновению всех форм паразита в орга­низ­ме животных [[39]].

Аналогичные результаты были получены на обезьянах [[40], [41]] и при ран­нем применении препарата, – в течение 24 ч после инфицирования (100 мг/кг) и через 7 суток после инфицирования (25 мг/кг) [[42]]. При этом препарат, как и ряд его аналогов оказался малотоксичным [[43]]. Активность препарата обусловлена из­би­рательным ингибированием экспрессии генов паразита [[44]]. В серии ана­ло­гов 1.11 по крайней мере 4 вещества проявили высокую шистосомоцидную ак­тив­ность, ингибируя развития паразита у инфицированных обезьян даже в кон­цен­трациях 12.5 мг/кг; побочные эффекты при этом практически отсутствовали [[45]].

Фунгицидная активность производных акридина убедительно проде­монст­ри­ро­вана серией работ индийских исследователей [12 – 17], причем наибольшую активность проявили гидразинсодержащие производные 1.12.

Бис-аналоги 1.13 проявили высокую противовирусную активность в экспериментах кури­ных эм­бри­о­нах от­но­сительно вируса гриппа А₂/Гонконг [24], а соединения 1.14 оказались высокоэффективными индукторами интерферона [[46]].

2          Обсуждение результатов

Для ранее синте­зированных соединений общей формулы 1.14 нами [[47]] было установлено существование таутомерного равновесия и показано, что соединения 1.14 в виде оснований предпочтительно находятся в “акридоновой” форме 1.14Б.

Было обнаружено, что соединения  REF _Ref167716185 \h 1.14 являются интеркаляторами ДНК средней силы и эффективно ингибируют матричные функции ДНК в условиях ПЦР [25], являются эффективными противовирусными [[48]] и интерферониндуцирующими агентами [46]. В связи с этим, в рамках рабочей гипотезы о потенциальной актив­ности интеркаляторов относительно любых объектов – носителей доступной ДНК, было выдвинуто предположение о наличии у соединений 2.1 –  REF _Ref167872078 \h 2.9 противо­бакте­риальной активности.

где NR₂ =

Для проверки этого предположения необходимо было ресинтезировать ранее описанные соединения 2.1 – 2.7, отработать методику получения и синтезировать неописанные ранее производные  REF _Ref167872164 \h 2.8 и  REF _Ref167872078 \h 2.9 и изучить их противо­бактери­альную активность.

2.1         Синтез исходных акридона, 9-хлоракридина и 9-метоксиакридина

Как уже было сказано в обзоре литературы, при получении 9-хлоракридина из N-фенилантраниловой кислоты умень­ше­ние избытка хлорокиси фосфора до 1.5-кратного (от расчетного) с разбав­ле­ни­ем реакционной среды хлороформом сни­жает опасность проведения синтеза и тру­до­емкость стадии нейтрализации, но не уменьшает количество образующихся в результате реакции смолистых примесей.

В связи с этим нами был разработан более удобный и безопасный способ по­лу­чения 9-хлоракридина 1.7, основными достоинствами которого являются повы­ше­ние выхода, считая на N-фенилантраниловую кислоту, и уменьшение смоло­обра­зо­вания.

На первой стадии из N-фенилантраниловой кислоты 1.5 получают 9,10-дигидро-9-ок­соакридин (акридон 1.2) по описанной в литературе методике [[49], стр. 18], причем выход акридона составляет 90 – 95 % (рис. 2.1).

Следует отметить, что, независимо от степени чистоты N-фенил­антра­ни­ло­вой кислоты, 1.2 получается хроматографически чистым непо­средственно из синтеза и последующая трансформация 1.2 в 1.7 про­ходит без образования побочных продуктов. В то же время при получении 1.7 из 1.5 качест­во исходного весьма сильно влияет на коли­чество смолистых примесей в продукте.

9-Хлоракридин получают на второй стадии (дезоксихлорировании), которую проводят твердофазным методом – спеканием тонкорастертой смеси 1.2 с расчетным количеством пентахлорида фосфора при 120 ^oC в течение 1 часа. Полу­чен­ный после охлаждения твердый конгломерат растирают в тонкий порошок в ша­ровой мельнице, который затем с помощью механической мешалки пере­меши­ва­ют с концентрированным раствором аммиака. Последующие фильтрование, про­мыв­ка, высушивание и экстракция сухого остатка хлороформом приводят к 9-хлор­акридину 1.7 с выходом 65 – 70 %. Сухой остаток после экстракции че­ты­рех­хло­рис­тым углеродом представляет собой чистый акридон (получается с выходом 25 – 32 %), который может быть повторно использован. Таким образом, общий вы­ход 9-хлор­ак­ри­дина в расчете на N-фенилантраниловую кислоту составляет 85 – 92 %.

На следующей стадии получения 9-метоксиакридина 1.8, несмотря на хорошие выходы (85 – 90 %) описанного в литературе метода и удобство про­ведения синтеза, этот метод требует на под­гото­ви­тель­ных стадиях получение абсолютного метанола и использование метал­ли­чес­ко­го натрия (пожаро-взры­во­опасность).

           Нами был модифицирован метод получения 1.8 и показана воз­можность использования в качестве основания 60 %-го раствора гидроксида ка­лия (или натрия) в коммерчески доступном метаноле (содержание влаги до 2 %).

Синтез 1.8 проводится (рис. 2.2) кипячением 1.7 в смеси 60 %-го водного раствора гидроксида калия и метанола в течение 8 ч. Избы­ток метанола удаляют, реакционную массу разлагают водой, фильтруют с после­дующей промывкой осадка водой, высушивают и перекристаллизовывают сырой продукт из петролейного эфира. В качестве побочного продукта с выхо­да­ми 10 – 15 % образуется акридон 1.2, который может быть повторно исполь­зо­ван для получения 9-хлоракридина. Таким образом при незначительном снижении выхо­дов (75 – 80 %) достигается снижение стоимости и повышение безопасности.

2.2         Синтез исходных гидразидов N,N-диалкилированого глицина

Обработка ранее полученных эфиров N,N-диалкилированого глицина 2.10 – 2.16 действием гидра­зин­гид­ра­та в ме­­та­ноле приводила к гидразидам  2.17 – 2.23 с хорошими выходами (рис. 2.3).

где NR₂ =

Чистоту соединений 2.17 – 2.23 контролировали методом ТСХ на пластинках Silufol UV-254; строение – данными ИК-спек­т­роскопии и масс-спек­трометрии.

Примечания: ¹ – некристаллизующееся маслообразное вещество; ² – элюирующая система – хлороформ : метанол (10:1)

В масс-спектрах гидразидов 2.17 – 2.23 имеются пики мо­ле­кулярных ионов низ­кой интенсивности. Наиболее характерным расщеплением мо­ле­кулярного ио­на яв­ляется разрыв b-связи аминоацильного остатка и связи N–N гид­ра­зина.

В ИК-спектрах гидразидов 2.17 – 2.23 по сравнению со спектрами эфиров отсутствует полоса при 1730 – 1735 см^-1 (карбонильная группа сложного эфира), но появля­ет­ся полоса при 1650 см^-1 (карбонильная группа гидразида). В области 3200 – 3450 см^-1 (с максимумом при 3350 – 3370 см^-1) появляется интенсивная широкая полоса с “плечами”, соответствующая валентным колебаниям связей N–H различной степени и вида ассоциации.

2.3         Синтез исходных гидразидов N,N-диалкилированой ГАМК

Обработкой g-бутиролактона   REF _Ref167870810 \h 2.24 тионилхлоридом в присутствии хлористого цинка с последующим метанолизом хлорангидрида  REF _Ref167870811 \h 2.25 получали метиловый эфир  REF _Ref167870812 \h 2.26. Замена галогена по Финкельштейну приводила к иодоэфиру  REF _Ref167870815 \h 2.27, обработкой которого избытком диэтиламина с последующим гидразинолизом аминоэфира  REF _Ref167870816 \h 2.28 получали гидразид  REF _Ref167870817 \h 2.29 (рис.  REF _Ref153622538 \h 2.4). Замещение атома хлора в  REF _Ref167870812 \h 2.26 на диэтиламиногруппу приводило к смеси продуктов, в которой доминирующим (по данным ТСХ) был амид  REF _Ref167870818 \h 2.30.

Аналогично, исходя из метилового эфира 4-пиперидинобутановой кислоты  REF _Ref167871065 \h 2.31  был получен соответствующий гидразид  REF _Ref167871073 \h 2.32.