Типирование групп крови по системе AB0 в криминалистических исследованиях

(Чудинов О. С., Пименов М. Г., Абрамова А. Б.)

("Эксперт-криминалист", 2007, N 3)

Текст документа

ТИПИРОВАНИЕ ГРУПП КРОВИ ПО СИСТЕМЕ AB0

В КРИМИНАЛИСТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

О. С. ЧУДИНОВ, М. Г. ПИМЕНОВ, А. Б. АБРАМОВА

Чудинов О. С., ведущий специалист ООО "ЛогТек", г. Москва.

Пименов М. Г., начальник отдела экспертиз биологических объектов ЭКЦ МВД России, кандидат юридических наук.

Абрамова А. Б., специалист направления ООО "ЛогТек", г. Москва.

Введение: история исследований

В 1900 году доктор Карл Ландштейнер установил, что сыворотка крови одного человека способна агглютинировать красные кровяные клетки другого человека [1]. При помощи реакции изоагглютинирования Ландштейнер в 1901 году показал существование трех групп крови и обозначил их как A, B и 0 [2]. В 1902 году на основе реакции изоагглютинирования при изучении группы пациентов доктора Декастелла и Стурли установили существование четвертого типа группы крови - смешанной AB [3]. Тогда же Карл Ландштейнер сделал предположение о существовании в крови двух специфических компонентов анти-A и анти-B, которые проводят реакцию изоагглютинирования, взаимодействуя со специфическими компонентами красных кровяных клеток. Однако открытие Ландштейнера не было замечено, и в 1907 году доктор Янской [4] и в 1910 доктор Мосс [5] повторно открывают четыре группы крови. В 1907 году было предложено обозначать группы крови латинскими цифрами I, II, III и IV.

В 1908 году доктора Эпстайн и Оттенберг проводят первое популяционное исследование групп крови системы I, II, III и IV [6]. Но, используя латинскую нумерацию по Янскому и Моссу и исходя из существования четырех независимых групп крови, они не могут установить точного механизма наследования.

В 1910 году доктора Дунгерн и Хирсзфельд, используя номенклатуру Ландштейнера и Декастелла - Стурли и исходя из существования трех независимых групп крови (A, B и 0) и одной смешанной (AB), провели популяционное исследование, давшее предположение о существовании двух независимых пар генов - пары A и a, определяющее присутствие или отсутствие агглютиногена A, и пары B и b, определяющее присутствие или отсутствие агглютиногена B [7].

В 1911 году Дунгерн и Хирсзфельд показали наличие подгрупп крови A1 и A2 [8]. Фактически это первое исследование, определившее наличие неоднородностей при серологической идентификации одной и той же группы крови и возможном наличии двух аллелей для гена, определяющего присутствие агглютиногена A.

Однако только в 1924 - 1925 годах была предложена модель наследования для системы групп крови AB0, признанная в настоящее время. Эта модель была предложена профессором математики Феликсом Бернштейном [9], [10]. Бернштейн решил проблему наследования, адаптировав для системы групп крови AB0 новый в то время метод популяционной генетики - закон Харди - Вайнберга, предложенный в 1908 году независимо английским математиком Харди и немецким врачом Вайнбергом. Бернштейн предложил модель трехаллельного (A, B и 0) наследования одного гена, подчиняющегося законом Менделя и осуществляющееся по кодоминантному типу (т. е. посредством двух независимых друг от друга аллелей A и B), а аллель 0 имеет рецессивный характер наследования.

До 1940 года для данной системы групп крови использовались две номенклатуры обозначения I, II, III, IV и AB0 - 0 (I), A (II), B (III), AB (IV). Но начиная с 1940 года из-за проблем, связанных с возникающими ошибками при переливаниях крови, в госпиталях повсеместно была утверждена номенклатура обозначения AB0.

Фактически за период с 1900 по 1960 год было создано одно из важнейших научно-практических направлений в гематологии и криминалистике - направление типирования групп крови по системе AB0, которое в настоящий момент используется во многих областях практической медицины. Наиболее полный обзор становления этого важнейшего направления до 1966 года представлен в работе одного из отцов современной гематологии и криминалистики профессора медицинской криминалистики Александра Винера [11].

Система AB0 является самым первым маркером типирования человеческой популяции. Кроу в своей работе подчеркнул, что в настоящее время известны тысячи полиморфизмов, используемых как человеческие хромосомные маркеры, а в первой половине XX века был только один маркер - система типирования групп крови AB0, хотя и с неустановленным до конца в то время механизмом наследования [12].

Несмотря на то что серологическое типирование групп крови стало использоваться в криминалистике начиная с 20-х годов прошлого столетия [11], наибольшее количество исследований по AB0-типированию в мире проводилось и проводится для клинических целей. Серьезное увеличение финансирования таких работ наблюдается в период активных боевых действий. Каждая крупная война с начала прошлого века характеризуется резким увеличением количества работ по изучению типирования групп крови. Вторая мировая война и война в Корее характеризуются наибольшим количеством таких работ [13], [14], [15], [16], [17] и т. д. Кроме увеличения финансирования работ в военный период, возрастает и число пациентов, которым необходимы трансфузиологические мероприятия, а соответственно, данные пациенты являются и обширным материалом для исследований.

Еще в начале прошлого века стало ясно, что группы крови могут делиться на подгруппы, что побудило проводить обширные популяционные исследования. Такие популяционные исследования и стали основой для создания тест-систем для криминалистического типирования AB0 [11].

Современные представления

Согласно современным представлениям A, B и H антигены (соответственно в старых работах: агглютиноген A, B или 0) являются продуктом не прямой экспрессии генов, а продуктом реакции ферментов, называемых гликозилтрансферазами. AB0-полиморфизм выражен в полиморфизме комплексов карбогидратных структур гликопротеинов и гликолипидов, экспрессирующихся на поверхности эритроцитов и других клеток, или присутствующих в жидкостных аналитах в форме гликановых единиц мициновых гликопротеинов. Ген, кодирующий A - и B-гликозилтрансферазу, расположен на 9-й хромосоме (район 9q34.1-34.2) [18]. A - и B-гликозилтрансферазы присоединяют к фукозилированному остатку галактозы антигена H N-ацетилгалактазамин с образованием антигена A (a-GalNAc (I1-3) (3-Gal (1-3 или 4) 18-GlcNAc)) или остатка галактозы с образованием антигена B (a-Gal (I1-3) 13-Gal (1-3 или 4) f8-GlcNAc), а также без изменения антигена H (a-8-Ga (I1-3 или 4)/3-GlcNAc) для случая 0 аллели [19]. Функции ABH антигенов в организме до сих пор не понятны.

Ген, кодирующий гликозилтрансферазу, состоит из 7 экзонов и 6 интронов (GenBank: http://www. ncbi. nlm. nih. gov, accession number NC_000009.10). Общая протяженность гена на физической карте генома человека составляет около 18 тысяч пар нуклеотидов [18], на физической карте генома человека с позиции 135140451 до позиции 135120384 (GenBank: http://www. ncbi. nlm. nih. gov, Chromosome 9, Location: 9q34.1-9q34.2, AB0 in Map Viewer). Размер экзонов колеблется от 28 до 688 пар нуклеотидов [20]. Размер интронов колеблется от 554 до 12982 пар нуклеотидов [21], [22], [23]. Два последних экзона кодируют каталитический домен AB0 гликозилтрансфераз [19], [20]. Из этого следует, что для генетического типирования A и B групп крови наиболее интересны именно 6-й и 7-й экзоны, в то время как для типирования группы 0 необходимо рассматривать более протяженный участок гена.

Поиск нуклеотидных различий для аллелей AB0 начался сразу после того, как в 1990 году был клонирован фрагмент кДНК длиной 1062 пары нуклеотидов, соответствующий мРНК варианта A-гликозилтрансферазы - белка весом 41 кДа [24]. Была определена первичная последовательность этого фрагмента кДНК (GenBank: http://www. ncbi. nlm. nih. gov, accession number NM_020469.02).

В том же 1990 году Ямамото с соавторами [24], [25] показал наличие четырех нуклеотидных замен, различающих гликозилтрансферазу A и B типов. Фактически это означало, что эксперименты Карла Ландштейнера [1] с кровью одного индивида и сывороткой другого блестяще подтвердились на молекулярном уровне спустя 90 лет [26].

В 1992 году были впервые проведены исследования возможности использования аллель-специфической полимеразно-цепной реакции (ПЦР) для идентификации AB0 аллелей [27], [28]. В работе [28] было исследовано 6 основных AB0 генотипов и была показана информативность ДНК-маркеров на уровне не менее 60 - 70%. Такие результаты позволили авторам работ сделать вывод о возможности использования ДНК-маркеров системы AB0 в криминалистических исследованиях.

В 1997 году был найден гибридный вариант аллели гена: экзон 6 соответствовал аллели B, а экзон 7 - аллели 01 [29]. Такой результат подтвердил возможность протяженных рекомбинационных перестроек внутри гена.

В 2001 году были исследованы случаи атипичных серологических определений методами анализа ДНК [30]. Атипичные случаи определений представляют серьезную проблему как в клинической практике, так и в криминалистической. Данные исследования прибавили к 14 известным к тому моменту аллелям AB0 еще 15 новых, в результате доведя общую численность до 29. 15 новых аллелей были определены как принадлежащие к A и B подгруппам. В исследовании использовался участок гена с фланкирующими районами, что позволило определить 2 аллели для A и B подгрупп вне экзона 7. Этот факт наиболее интересен, поскольку эти две аллели лежат вне зоны, непосредственно кодирующей каталитический центр трансферазы. Эти аллели получили название "weak" (мягкие).

Уже к 2002 году было определено свыше 70 основных аллелей, которые соответствуют нормальным группам крови A, B, AB и 0 [31]. Часть из этих аллелей соответствовала вариациям первичной последовательности ДНК в некодирующих областях, в том числе и в интроне 6. Ответственными за возникновение части этих аллелей было предложено считать мутационные и внутригенетические рекомбинационные процессы (кроссовер и генетическую конверсию). В работе [31] была предложена унифицированная номенклатура обозначения этих аллелей.

К 2003 году было сообщено об определении 83 [32], а затем и 88 [33] аллельных вариантов. В работах [32], [33] было показано наличие большого количества вариаций первичной последовательности ДНК в интронах и некодирующих областях гена. Ольга Блюменфельд [33] в своей работе систематизировала данные для генетического типирования AB0 и разработала первую базу данных, состоящую к тому времени уже из 88 аллелей. В 2004 году на конференции в Торонто (Канада) сотрудники департамента биохимии Медицинского колледжа им. Альберта Эйнштейна Ольга Блюменфельд и Сантошо Патнаик предложили на рассмотрение окончательно сформированную базу данных по генетическим вариациям антигенов групп крови, в том числе и системы AB0 [34].

К настоящему моменту определено порядка 180 аллелей для AB0 системы. Сотрудники департамента биохимии Медицинского колледжа им. Альберта Эйнштейна составили уже электронную базу данных вариаций в генах, кодирующих антигены разных систем групп крови, в том числе и для системы AB0 (BGMTU: http://www. aecom. yu. edu/bgmut/index. htm). По состоянию на июль 2007 года в базе содержится информация для 62 аллелей группы A, для 46 аллелей группы B, для 66 аллелей группы 0 и для 5 cis-аллелей (трансферазы, экспрессируемые с cis-аллелей, обладают смешанной AB-активностью [35], [36], [37], [38]).

Основные аллели и вариации первичной последовательности ДНК

Основные типы аллелей групп крови по системе AB0 можно разделить на следующие группы: A, B, 0, cis-AB. Далее все аллели приводятся в соответствии с номенклатурой базы данных департамента биохимии Медицинского колледжа им. Альберта Эйнштейна (BGMTU: http://www. aecom. yu. edu/bgmut/index. htm) и в соответствии с работами [30], [31]. Необходимо отметить, что высокое аллельное разнообразие стало доступно только после начала исследования системы AB0 на уровне первичной последовательности ДНК и зачастую изучение свойств новых аллелей серологически происходило после их открытия методами ДНК-исследований гена.

Ниже приводится краткая характеристика наиболее интересных подгрупп аллелей.

Аллели группы A

Фенотипически (по результатам серологических определений) делятся на подгруппы A1, A2, A3, Ael, Aweak, Am, Aw, Ax. Генетическое деление аллелей намного сложнее. Согласно данным Ямамото [21], отличительной особенностью генотипов аллелей группы A (по сравнению с группой B) является наличие следующих характеристических нуклеотидов в соответствующих позициях (отсчет ведется по кДНК [21]): поз. 294 (A), 523 (C), 654 (C), 700 (G), 793 (C), 800 (G), 927 (G). Для первичной последовательности кДНК, представленной в GenBank (GenBank: http://www. ncbi. nlm. nih. gov, accession number NM_020469.02), для правильного определения позиций нуклеотидов необходимо сделать сдвиг отсчета нуклеотидов на -3. Четыре из характеристических нуклеотида: 526 (здесь позиции в соответствии с GenBank: http://www. ncbi. nlm. nih. gov, accession number NM_020469.02), 703, 796 и 803 - определяют тип трансферазы (A или B), поскольку лежат в области кодирования каталитического центра фермента и замены нуклеотидов приведут к заменам аминокислотных остатков в самом ферменте и изменению активности (миссенс-замены).

По степени выраженности реакции агглютинации можно разделить аллели группы A на сильные (A1) и слабые (A2, A3, Ael, Aweak, Am, Aw, Ax). Генотип слабых аллелей формируется в основном за счет определенных замен нуклеотидов на участке, кодирующем каталитический центр (в основном), что приводит к сохранению типа трансферазы, экспрессируемой с данной аллели, но потере ферментативной активности (аналогично и для группы B).

Подгруппы A1 и A2 были определены еще в исследованиях 1911 года [8] и были заново открыты в 1923 году Кокой и Клейном [39]. Это классические подгруппы группы A, каждая из которых характерна своим ферментом и антителами, специфически узнающими A1 или A2. Выраженность реакции агглютинации для аллели A1 обычно принимают за 100%, и тогда выраженность реакции агглютинации для аллели A2 будет ниже 40%. Подгруппа A2 встречается примерно у 20% лиц с группами крови A и AB. Усредненная частота встречаемости аллели A2 - около 3 - 5% [40]. Антиагглютиноген A2 определяется специальными активными сыворотками или лектинами [11], [41]. При отсутствии активных сывороток анти-A лица с генотипом A20 могут быть ошибочно отнесены к группе крови 0, а лица с генотипом A2B могут быть ошибочно отнесены к группе крови B [41].

Аллель A1 в гетерозиготном состоянии хорошо маскирует при серологическом определении аллели более слабые Ael и Ax [30].

Аллель A2 отличается от A1 наличием замены в поз. 297 (C на T, соотв. Pro на Leu) и делеции в поз. 1059 [24], [25], [42].

Аллели A3, Ael, Ax характерны тем, что в их случае наблюдается усиленная экспрессия H-антигена [43], [44].

Подгруппа Aweak характеризуется крайне низкой A-агглютиногеновой активностью - на уровне 10 - 12% [19].

Аллели группы B

Согласно данным Ямамото [21], отличительной особенностью генотипов аллелей группы B (по сравнению с группой A) является наличие следующих характеристических нуклеотидов в соответствующих позициях (отсчет ведется по кДНК [21]): поз. 294 (G), 523 (G), 654 (T), 700 (A), 793 (A), 800 (C), 927 (A). Для первичной последовательности кДНК, представленной в GenBank (GenBank: http://www. ncbi. nlm. nih. gov, accession number NM_020469.02), для правильного определения позиций нуклеотидов необходимо сделать сдвиг отсчета нуклеотидов на -3. Четыре из характеристических нуклеотида: 526 (здесь позиции в соответствии с GenBank: http://www. ncbi. nlm. nih. gov, accession number NM_020469.02), 703, 796 и 803 - определяют тип трансферазы (см. выше).

Фенотипически (по результатам серологических определений) делятся на подгруппы B, B(A), AweakB, (B(A), определяемая как AwB), B3, Bw, (B в Bvar/001 или A1B3 в A101/Bvar), Bel, Bel (очень слабая B-антигеновая экспрессия), Bx.

По степени выраженности реакции агглютинации можно разделить аллели группы B (так же как и аллели группы A) на сильные и слабые (к сильным принадлежит аллель B, все остальные - слабые).

Интересна также подгруппа B(A), для которой характерна пониженная B-трансферазная активность вследствие замены Pro234 на Ala из-за замены C на G в поз. 703 первичной последовательности ДНК (отсчет по кДНК [45], для соответствия NM_020469.02 нужно сделать сдвиг -3) [46]. Существенная потеря трансферазной активности в данном случае происходит из-за изменения каталитического центра фермента (7-й экзон). Для такой аллели при серологическом исследовании наблюдается существенное возрастание A - агглютиногенной активности, что может привести к неправильному определению фенотипа.

Аллели группы 0

Фенотипически (по результатам серологических определений) эта группа обычно не разделяется на подгруппы. Однако существуют варианты отсутствия и присутствия немодифицированного антигена H. Антиген H может отсутствовать из-за потери экспрессии самого антигена H (за синтез и модификацию которого ответственны H (FUT1) и SE (FUT2) локусы, расположенные на 19-й хромосоме). Фенотип 0h получил название "бомбейского" в соответствии с названием первой популяции, в которой его обнаружили [47]. Отсутствие антигена H представляется весьма редким случаем, но для них может наблюдаться несоответствие результатов серологического определения методам анализа первичной последовательности ДНК, т. е., несмотря на присутствие трансфераз A или B типа, серологическое тестирование всегда будет определять 0.

Генотип 01 характерен наличием делеции G (по сравнению с A1) в поз. 261 (по кДНК, NM_020469.02), из-за чего образуется стоп-кодон (нонсенс-замена) в поз. 118 [48]. Поэтому такая аллель экспрессирует каталитически неактивный фермент.

Генотип 02 характерен (по сравнению с A1) наличием нуклеотидов в поз. 297 (G), 526 (G), 802 (A). Значимой является только замена в 526 и 802 [21], [42], [49], нумерация соответствует работе [45], для соответствия NM_020469.02 нужно сделать сдвиг -3.

Аллели группы cis-AB

Характеризуется смешанной AB-трансферазной активностью. Например, смешанная AB-трансферазная активность наблюдалась вследствие замены Pro 156 на Leu из-за замены C на T в поз. 467 первичной последовательности ДНК (отсчет по кДНК [24]). Активность трансферазы для такой аллели слабая - меньше 50% [19], [50], [51], [52], [53], [54], [55].

К настоящему моменту известно много вариаций первичной последовательности ДНК-гена, кодирующего гликозилтрансферазы (соответствующее A-, B - или 0-антигену), в дополнение к тем, что приведены в данной работе.

Анализ частот встречаемости

Первое популяционное исследование по системе AB0 было проведено в 1910 году докторами Дунгерном и Хирсзфельдом (см. выше [7]), а первое предложение использовать систему AB0 для анализа этнического происхождения была высказано в 1918 - 1919 годах [56]. Данные, полученные в то время, свидетельствовали о том, что частота встречаемости генотипа, определяемого серологически как B, постепенно увеличивается при движении по Евразии от 10% (Англия) до 50% (Индия). Частоты встречаемости генотипа, определяемого серологически как A, примерно одинакова по всей Европе, незначительно ниже в России и на Среднем Востоке. А в Африке и Индии частота встречаемости группы A существенно уменьшается. Усредненный "биохимический показатель" - отношение частоты группы A к частоте группе B, введенный в работе [56], позволил выделить три группы человеческой расы: европейскую (2,5 - 4,5), азиатско-африканскую (0,5 - 1,09) и смешанную (1,3 - 1,5) [57].

Различия в частотах встречаемости аллелей, определяющих группы крови, хорошо отражают дифференциацию генофонда населения Земли в целом [57].

Географические границы позволяют выделить пять расовых групп: африканскую, европеоидную (кавказскую), негроидную, монголоидную, индейцы Америки, аборигены Австралии. В таблице 1 представлены частоты встречаемости аллелей групп крови A и B среди мировых популяций [58]. Данные по американской популяции приведены в таблице 2.

Таблица 1. Частоты аллелей (%), определяющих

группы крови A и B по состоянию на 1973 год [58]

Аллель Европеоиды Негроиды Монголоиды Индейцы Аборигены

(кавказоиды) Америки Австралии

IA 24 - 38 15 - 25 15 - 25 0 - 55 20 - 45

IB 5 - 20 10 - 20 15 - 30 0 0

Таблица 2. Данные по средним частотам встречаемости (%)

в американской популяции по состоянию на 2006 год

Аллель Европеоиды Негроиды Азиаты

(кавказоиды)

IA1 22 12 18

IA2 7 6 Мало

IB 6 12 17

I0 65 70 65

Необходимо отметить, что индейцы Южной Америки проявляют в основном фенотип, соответствующий аллели 0, в то время как частоты встречаемости других аллелей крайне малы.

Данные для жителей стран СНГ совпадают с данными для мировых популяций. Например, данные по частотам встречаемости для жителей Украины представлены в таблице 3.

Таблица 3. Частоты аллелей (%), определяющих группы крови

у жителей Украины, по состоянию на 1987 год [41], [59]

Аллель Жители Украины

I0 33,25

IА 38,44

IB 20,6

IАВ 7,7

Однако серологическая дифференциация человеческого населения Земли по системам групп крови AB0 в криминалистике иногда бывает несколько затруднена из-за наличия большого количества обособленных и условно-обособленных популяционных группировок с эффектом "бутылочного горлышка" и очень резкими частотными границами [57].

Изменчивость частот групп крови по системе AB0, определяемых серологическими методами, относительно невысока по сравнению с другими системами определения групп крови [57]. Однако высокое разнообразие первичной последовательности ДНК-гена, кодирующего A - и B-гликозилтрансферазу, позволяет существенно расширить количество генотипов, используемых для идентификации.

Атипичные случаи серологического определения

У человека окончательная картина экспрессии антигенов ABH и соответствующих им антител формируется постепенно. Антигены начинают устойчиво идентифицироваться только с 5-й недели развития плода. У новорожденных эритроциты имеют сниженное число группоспецифических антигенов, которые достигают своей нормальной активности только к 3 годам. В сыворотке крови новорожденных антитела анти-A и анти-B находятся в низком титре, а у недоношенных детей почти отсутствуют. Только с 3 - 6-го месяца после рождения групповые изогглютиногены начинают обнаруживаться устойчиво и достигают пика титра к 5 - 10 годам. С 5 до 70 лет наблюдается плато с примерно одинаковым титром антител и агглютиногенной активностью клеток крови (в отсутствие трансфузиологических и трансплантологических мероприятий). Снижение титра наблюдается примерно к 80 - 100 годам и приближается к уровню новорожденных [41], [60].

Группа крови в течение жизни при нормальных условиях остается неизменной, но под действием патологических процессов экспрессия эритроцитарных антигенов может ослабеть или полностью остановиться. Чаще всего это происходит при злокачественных заболеваниях [41], [61], [62]. Наибольшим изменениям подвергается антиген A под действием бактериальных ферментов, особенно тех, которые ассоциированы с кишечными инфекциями: может происходить деацилирование антигена A, и тогда у лиц с генотипом A может наблюдаться фенотип B. Несколько пациентов, больных гастроэнтеральными инфекциями [43], [63], показали наличие в крови антиагглютиногена B, достаточное для устойчивого определения, в то время как их генотипы соответствовали аллелям группы A. После выздоровления нормальный фенотип восстановился [30], [43], [63].

Известно также об изменениях способности к образованию групповых антител анти-A и анти-B и агглютиногенов A - и B - при злокачественных и незлокачественных новообразованиях [64]. Изменение AB0-статуса наблюдается при таких заболеваниях, как миелогенная лейкемия, множественные миеломы, лимфома Ходжкина, миелодиспластический синдром, аденокарциномы кишечника или уретры, гинекологические карциномы. Например, при некоторых разновидностях лимфом кровь некоторых пациентов показывает наличие полиагглютиногена, хотя генотип соответствует 0101V. Так же кровь некоторых пациентов, больных миелодиспластическим синдромом, показывает наличие агглютиногена, определяемого как A, хотя генотип соответствует 01V01V [30].

Беременность также является фактором, влияющим на правильность определения AB0-статуса. Например, в крови беременных женщин было определено наличие крайне слабого агглютиногена A, идентифицированного как Aweak, хотя их генотип соответствовал чистому A. Вариабельность в экспрессии A-агглютиногена у беременных практически повсеместно признана нормальным сопутствующим явлением. У некоторых такое ослабление наблюдается в течение лишь короткого периода беременности (обычно первые 6 месяцев после зачатия), а у некоторых сохраняется достаточно длительное время после рождения ребенка, но нормальная экспрессия восстанавливается практически во всех случаях. Такая картина наблюдается, как правило, для гетерозиготного генотипа с участием аллели A [30].

У пациентов, перенесших многократные хирургические операции (в том числе и ортопедические), может содержаться в крови агглютиноген, не совпадающий с генотипом, или слабо экспрессируемый агглютиноген собственной аллели [30].

Существенное ослабление экспрессии агглютиногена A и B (в основном это касается A-агглютиногена) до уровня мягких аллелей наблюдается у регулярных доноров и больных, перенесших химиотерапию [30].

При клинических исследованиях среди групп больных встречается до 20 - 30% абнормальных случаев определения группы крови по системе AB0 серологическими методами [30], [43], [63]. Поэтому для криминалистических исследований целесообразней использовать более достоверные методы - методы изучения первичной последовательности ДНК.

ДНК тест-системы для определения генотипа AB0 и ограничения,

накладываемые сохранностью и количеством биоматериала

Для исследования генотипов системы AB0 за последние 17 лет после определения первичной последовательности кДНК и последовательности самого гена было использовано множество различных тест-систем. Однако ограничения на тест-системы при криминалистических исследованиях не позволяют использовать любые, которые пригодны для медицинских целей. Криминалистические образцы биоматериала с места происшествия характеризуются плохой сохранностью, наличием примесей и загрязнений, малым количеством ДНК для исследований, сильной степенью деградации ДНК. Поэтому для ДНК-исследований криминалистических образцов необходимо использовать тест-систему, которая позволяет анализировать относительно короткие фрагменты деградированной ДНК, совмещать много реакций в одной пробирке (мультиплексный ПЦР), анализировать малые и сверхмалые количества сильно деградированной ДНК и достоверно устанавливать генотипы.

Хорошо подходит для генетического типирования групп крови по системе AB0 метод анализа однонуклеотидных замен (single nucleotides polimorphism) SNP, поскольку основные генотипы аллелей определяются именно за счет однонуклеотидных замен. Принцип метода основан на анализе первичной последовательности ДНК относительно короткого локально-амплифицированного района генома (от 50 до 250 п. н.). Анализ первичной последовательности может проводиться в трех основных вариантах: прямым секвенированием, методом SSCP (single strand conformation polimorphism) - конфармационного полиморфизма одноцепочечной ДНК и методом детекции на микрочипах. SNP-метод хорошо подходит для анализа сильно деградированной ДНК, поскольку для определения полиморфизма не требует протяженных фрагментов ДНК (как, например, STR) и позволяет одновременно анализировать несколько локусов [65]. В случае определения полиморфизма на микрочипах SNP-метод становится крайне время - и затратосберегающим. Многие исследователи использовали SNP-метод для исследования криминалистических образцов по системе AB0.

Наиболее интересные ДНК тест-системы для исследований генотипов AB0 приводятся в работах [30], [32], [40], [42], [44], [65], [66], [67] и т. д.

Проблемы, возникающие при криминалистических исследованиях, хорошо изложены в работах [65], [67]. Авторы рассматривают случай сильно деградированной ДНК из костных останков плохой сохранности. В работе [65] использовались праймерные пары:

AB01 (5'-GCAGTAGGAAGGATGTCCTC-3')

AB02 (5'-GACCTCAATGTCCACAGTCA-3')

AB0S-1 (5'-AGTAGGAAGGATGTCCTCGT-3')

AB0S-2 (5'-CTTCTTGATGGCAAACACAG-3').

В работе тестировались поз. 261 и 297 (по кДНК). Продукт амплификации для первой праймерной пары имеет размер 205 п. н., а для второй - 138 п. н. Как видно из первичной последовательности (GenBank: http://www. ncbi. nlm. nih. gov, accession number NM_020469.02), вторая праймерная пара лежит внутри фрагмента амплифицируемого первой праймерной парой (всего на несколько нуклеотидов выходя за его границы с одного конца) и оба фрагмента амплифицируются с 6 экзона. В результате проведенного исследования было показано, что из 6 образцов (сильно загрязненных костных останков плохой сохранности) 4 были хорошо идентифицированы по малому фрагменту, а по большому - идентифицирован лишь 1 образец. Аналогичные результаты были получены также для разных типов загрязненного биоматериала плохой сохранности.

Учитывая опыт своей предыдущей работы [65], в дальнейших исследованиях [67] авторы использовали 3 фрагмента локальной амплификации: первые два из предыдущей работы, а третий был получен с использованием дополнительного обратного праймера 5'-CTGCTCGTCGAGGATGTCGA-3', а прямой был один из предыдущей работы. После амплификации с дополнительным праймером был получен фрагмент размером 89 п. н. Относительное количество образцов, которое удалось типировать, совпало приближенно с предыдущими исследованиями, но для 89 п. н. фрагмента количество случаев удавшегося типирования было наибольшим. Из результатов этих работ можно сделать вывод, что размер амплификационного фрагмента для тестирования криминалистических образцов плохой сохранности (костных останков) должен быть меньше 200 п. н., а оптимальный размер - не более 100 п. н.

Заключение

До настоящего времени 90 - 95% объектов биологического происхождения, изымаемых с мест происшествий, исследуется традиционными (серологическими) методами исследования, так как не требует больших финансовых затрат и дорогостоящего оборудования. Учитывая то, что эти объекты чаще всего характеризуются наличием примесей и загрязнений различного характера, в том числе бактериальных и грибковых, малым количеством, последствиями воздействия неблагоприятных условий внешней среды (влажность, температура, ультрафиолетовое излучение и др.), часто традиционными методами исследования не удается установить группу крови по системе AB0, или она устанавливается недостоверно. Необходимость установления группы крови по системе AB0 в биоматериале с мест происшествий обусловлена тем, что она относится к самой распространенной в медицинской практике, в связи с чем есть возможность проведения поиска лица путем проведения сравнения результатов исследований с записями о группе крови в историях болезни, медицинских картах, паспортах. Это очень важно на первых этапах расследования, так как позволяет сузить круг подозреваемых лиц. Поэтому для установления системы AB0 в криминалистических образцах необходима разработка ДНК тест-систем, которые не только позволят анализировать малые и сверхмалые количества биоматериала и достоверно устанавливать генотипы, но и были бы удобны в практическом применении экспертами-биологами, что позволит существенно сэкономить время и средства. А современные научные разработки в этом направлении позволят осуществить эту задачу в кратчайшие сроки.

Литература

1. Landsteiner K. Zur Kenntnis der antifermentativen, lytischen und agglutinierender Wirkungen des Blutsterums und der Lymphe // Zbl. Bakt., 1900, N 28.

2. Landsteiner K. Ueber Agglutination-sercheinungen normalen menschlichen Blutes // Wien. Klin. Wchnschr., 1901, N 14.

3. Von. Decastello A., Sturli A. Uber die Isoaglutinine im Serum gesunder und kranker Menschen // Munch. Med. Wchnschr., 1902, N 49.

4. Jansky J. Haematologicke, studie u psychotiku. Etudes hematologiques, dans les maladies mentalies // Sbornik Klin., 1907, N 8.

5. Moss W. L. Studies on isoagglutinins and isohemolysins // Bull. Johns Hopkins Hosp., 1910, N 21.

6. Epstein A. A., Ottenberg R. Simple method of performing serum reactions // Proc. N. Y. Path. Soc., 1908, N 8.

7. Von Dungern E., Hirszfeld L. Ueber Vererbung gruppenspezifischer Strukturen des Blutes // Ztschr. f. Immunit tsforsch, 1910, N 6.

8. Von Dungern E., Hirszfeld L. Ueber gruppenspezifischer Strukturen des Blutes // Ztschr. f. Immunit tsforsch, 1911, N 8.

9. Bernstein F. Ergebnisse einer biostatischen zusammenfassenden Betrachtung uber die erblichen Blutstrukturen des Manschen // Klin. Woch., 1924, N 3.

10. Bernstein F. Zusammenfassenden Betrachtung uber die erblichen Blutstrukturen des Manschen // Ztschr. Induct (Abstamm. u. Vererbungs), 1925, N 37.

11. Wiener A. S. The Blood Groups. Three Fundamental Problems - Serology, Genetics and Nomenclature // Blood, vol. 27, 1966, N 1 (January).

12. Crow J. F. Felix Bernstein and the first human marker locus // Genetics, 1993, N 133.

13. Board for the Study of the Severely Wounded: The Physiologic Effects of Wounds // Washington, D. C., U. S. Government Printing Office, 1952.

14. Ebert It. V., Emerson C. P. A clinical study of transfusion reactions: the hemolytic effect of group 0 blood and pooled plasma containing incompatible isoagglutinins // J. Clin. Investigation, 1946, N 25.

15. Ervin D. M., Christian It. M., Young L. E. Dangerous universal donors. II. Further observations on in vivo and in vitro behavior of isoantihodies of immune type present in group 0 blood // Blood, 1950, N 5.

16. Tisi N. L.H., Garland D. M., et. al. The effects of the transfusion of group 0 blood of high isoagglutinin titer into recipients of other blood groups // Am. J. Clin. Path., 1946, N 16.

17. William H., Akeroyd J. Some Immunohematologic Results of Large Transfusions of Group 0 Blood in Recipients of Other Blood Groups A Study of Battle Casualties in Korea // The Journal of Hematology, 1954 (February), vol. IX, N 2.

18. Ferguson-Smith M. A., Aitken D. A. et. al. Localisation of the human AB0: Np-1: AK-1 linkage group by regional assignment of AK-1 to 9q34 // Hum. Genet., 1976, N 34.

19. Yoshida A. Biochemical Genetics of Human Blood Group AB0 System // Am. J. Hum. Genet., 1982, N 34.

20. Seltsam A., Hallensleben M., et. al. The nature of diversity and diversification at the AB0 locus // Blood, 2003, vol. 102, N 8.

21. Yamamoto F., Clausen H., et. al. Molecular genetic basis of the histoblood group system // Nature, 1990, N 345.

22. Yamamoto F., McNeill P. D., Hakamori S. Genomic organization of human histoblood group AB0 genes // Glycobiology, 1995, N 5.

23. Bennett E. P., Steffensen R., et. al. Genomic cloning of the human histo-blood group AB0 locus // Biochem. Biophys. Res. Comm., 1995, N 206.

24. Yamamoto F., Marken J., et. al. Cloning and characterization of DNA complementary to human UDP-GalNAc:Fuc alpha 1--2Gal alpha 1--3GalNAc transferase (histoblood group A transferase) mRNA // J. Biol. Chem., 1990, N 265.

25. Yamamoto F., McNeill P. D., Hakamori S. Human histoblood group A transferase coded by A allele, one of the A subtypes, is characterized by a single base deletion in the coding sequence, which results in an additional domain at the carboxyl terminal // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, N 187.

26. Fincham J. R.S. Mendel--now down to the molecular level // Nature, 1990, N 343.

27. Ugozzoli L., Wallace R. B. Application of an allele-specific polymerase chain reaction to the direct determination of AB0 blood group genotypes // Genomics, 1992, N 12.

28. Johnson P. H., Hopkinson D. A. Detection of AB0 blood group polymorphism by denaturing gradient gel electrophoresis // Hum. Molec. Genet., 1992, N 1.

29. Suzuki K., Iwata M., et. al. A de novo recombination in the AB0 blood group gene and evidence for the occurrence of recombination products // Hum. Genet., 1997, N 99.

30. Olsson M. L., Irshaid N. M., et. al. Genomic analysis of clinical samples with serologic AB0 blood grouping discrepancies: identification of 15 novel A and B subgroup alleles // Blood, 2001, N 98.

31. Yip S. P. Sequence variation at the human AB0 locus // Ann. Hum. Genet., 2002, N 66.

32. Seltsam A., Hallensleben M., et. al. The nature of diversity and diversification at the AB0 locus // Blood, 2003, N 102.

33. Blumenfeld O. O. The AB0 gene--more variation! (Letter) // Blood, 2003.

34. Blumenfeld O. O., Patnaik S. K. Phenotypes vs Genotypes in World of Blood Group Antigens // Abstract HGVS meeting Toronto, 2004 (October).

35. Seyfried H., Walewska I., Werblinska B. Unusual inheritance of AB0 group in a family with weak B antigens // Vox Sang., 1964, N 9.

36. Yamaguchi H., Okubo Y., Hazama F. An A(2)B(3) phenotype blood showing atypical mode of inheritance // Proc. Jpn. Acad., 1965, N 41.

37. Yamaguchi H., Okubo Y., Hazama F. Another Japanese A(2)B(3) blood-group family with the propositus having 0-group father // Proc. Jpn. Acad., 1966, N 42.

38. Yamamoto F., McNeill P. D., et. al. Molecular genetic analysis of the AB0 blood group system. 2. cis-AB alleles // Vox Sang., 1993, N 64.

39. Coca A. F., Klein H. Hitherto undescribed pair of iso-agglutination elements in human beings // J. Immunology, 1923, N 8, P. 477.

40. Villa A., et. al. AB0 Genotyping in Italian blood donors // Haematologica, 1996, N 81.

41. Перехрестенко П. М., Павлюк Р. П., Исакова Л. М. Группоспецифические антигены системы AB0 человека и современные методы их выявления (К 100-летию открытия групп крови) // Украинский медичний часопис, 2000 (IX/X), N 5(19).

42. Gassner C., et. al. AB0 Glycosyltransferase Genotyping by Polymerase Chain Reaction Using Sequence-Specific Primers // Blood, 1996, vol. 88, N 5 (September I).

43. Daniels G. Human Blood groups. Oxford (UK): Blackwel Scientific. 1995.

44. Sousa N. C., et. al. The relationship between AB0 groups and subgroups, factor VIII and von Willebrand factor // Haematologica / The Hematology Journal, 2007, N 92(02).

45. Yamamoto F. Molecular genetics of the AB0 histoblood group system // Vox Sang., 1995, N 69.

46. Yu L.-C., et. al. The molecular basis for the B(A) allele: an amino acid alteration in the human histoblood group B alpha-(1,3)-galactosyltransferase increases its intrinsic alpha-(1,3)-N-a cetylgalactosaminyltransferase activity // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, N 262.

47. Kelly R. J., et. al. Molecular basis for H blood group deficiency in Bombay (0h) and para-Bombay individuals // Proc. Nat. Acad. Sci., 1994 (June), vol. 91.

48. Ogasawara K., et. al. Molecular Genetic Analysis of Variant Phenotypes of the AB0 Blood Group System // Blood, 1996, vol. 88, N 7 (October I).

49. Yamamoto F., et. al. Molecular genetic analysis of the AB0 blood group system: 4. Another type of 0 allele // Vox Sang., 1993, N 64.

50. Boettcher B. Modification of Bernstein's multiple allele theory for the inheritance of the AB0 blood groups in the light of modern genetical concepts // Vox Sang., 1966, N 11.

51. Yoshida A., Yamaguchi H., Okubo Y. Genetic mechanism of Cis-AB inheritance. I. A case associated with unequal chromosomal crossing over // Am. J. Hum. Genet., 1980, N 32.

52. Yoshida A. Identification of genotypes of blood group A and B // Blood, 1980, N 55.

53. Yamaguchi H., Okubo Y., Hazama F. An A2B3 phenotype blood showing an atypical mode of inheritance // Proc. Jpn. Acad., 1965, N 41.

54. Reviron J., Jacquet A., Salmon C. // Un exemple de chromosome "CisA1B". Etude immunologique et genetique de phenotype induit // Nouv. Rev. Fr. Hematol., 1968, N 8. S. 323 - 338.

55. Madsen G., Heisto H. A Korean family showing inheritance of A and B on the same chromosome // Vox Sang., 1968, N 14. P. 211 - 217.

56. Hirszfeld L., Hirszfeld H. Essai d'application des methodes srologiques au probleme des races // Antropologie, 1919, N 29. S. 505 - 537.

57. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика / Перевод с англ. Том 3. Москва: Мир, 1988.

58. Stern C. Principals of Human Genetics. 3-ed edition. W. H.Freeman (San Francisco), 1973.

59. Тимошенко Л. И. Распространенность групп крови системы AB0 и RhoD-фактора на территории Украинской ССР // Сборник "Гематология и переливание крови". Киев: Изд. "Здоровье", 1987. Вып. 22.

60. Косяков П. Н. Изоантигены и изоантитела человека в норме и патологии. Москва: Медицина, 1997.

61. Davidsohn J., Kovarlik S., Ni L. Isoantigens A, B and H in benning and malignat lesions of the cervix // Arch. Pathol., 1969, N 87.

62. Salmon C. Blood group changes in preleukemic states // Blood Cells, 1976, N 3.

63. Vengelen-Tyler V. Technical manual. Bethesda (MD): American association of blood banks. 1999.

64. Лобуи Дж., и др. Современная гематология и онкология / Пер. с англ. Москва: Медицина , 1983.

65. Utsuno H., et. al. Influence of template DNA degradation on the genotyping of SNPs and STR polymorphism from forensic materials by PCR // Bull. Tokyo dent. Coll., 2004, vol. 45, N 1.

66. Chang J.-G., et. al. Rapid Genotyping of AB0 Blood Group // Blood, 2000, N 32.

67. Minaguchi K., et. al. Identification of Unknown Body Using DNA Analysis and dental characteristics in Chest X-ray Photograph // Bull. Tokyo dent. Coll., 2005, vol. 46, N 4.

Название документа